血漿凝固酶試驗(yàn)操作步驟

【原理】
病原性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附于細(xì)菌表面，生成凝塊，因而具有抗吞噬的作用。凝固酶試驗(yàn)對(duì)于判定該菌株是否具有致病力，很有幫助。葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。

葡萄球菌所產(chǎn)生的凝固酶有兩種：結(jié)合凝固酶和游離凝固酶。

結(jié)合凝固酶（即凝聚因子）：是一種結(jié)合于菌體細(xì)胞壁的酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使之變成纖維蛋白，而使葡萄球菌凝集成塊，玻片法陽(yáng)性結(jié)果是由此酶（凝聚因子）所致。

游離凝固酶：是凝血酶原樣物質(zhì)，不直接作用于血漿纖維蛋白原上，而被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變?yōu)楣虘B(tài)纖維蛋白，從而使血漿凝固。試管法的陽(yáng)性結(jié)果為此酶所致。

【方法】
（1）玻片法：在1張潔凈玻片中央加1滴9g／L氯化鈉(生理鹽水)溶液，用接種環(huán)取待檢培養(yǎng)物與其混合（設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照）制成菌懸液，若經(jīng)10～20s內(nèi)無(wú)自凝現(xiàn)象發(fā)生，則加入兔新鮮血漿1環(huán)，與菌懸液混合，觀察結(jié)果。
（2）試管法：用生理鹽水將新鮮兔血漿4倍稀釋?zhuān)?/span>0．5ml于試管再加0.5ml待測(cè)菌濃菌懸液（需做陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。），混勻后置37℃水浴中，每30min觀察1次結(jié)果。若3小時(shí)內(nèi)試驗(yàn)管和陽(yáng)性對(duì)照管出現(xiàn)凝固，陰性對(duì)照管（即濃菌液管）不凝固，為陽(yáng)性；若陰性，繼續(xù)觀察到24小時(shí)，不凝固者為陰性。

【結(jié)果判斷】
（1）玻片法：5～10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性。
（2）試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽(yáng)性。4h后無(wú)上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過(guò)夜后再觀察。

【應(yīng)用】
本試驗(yàn)僅用于致病性葡萄球菌的鑒定。

【注意事項(xiàng)】
（1）玻片法：10秒內(nèi)觀察結(jié)果，如超過(guò)10?秒可出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此必須用試管法驗(yàn)證凝聚因子試驗(yàn)。

（2）可選擇的玻片凝集試驗(yàn)法還包括檢測(cè)凝集因子和蛋白A的膠乳凝集試驗(yàn)。但膠乳凝集試驗(yàn)和玻片凝固酶試驗(yàn)的結(jié)果并不完全一致。盡管膠乳凝集試驗(yàn)鑒定路鄧葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis）的可靠性較差，但鑒定金黃色葡萄球菌的特異性和靈敏性均高于傳統(tǒng)的玻片凝固酶試驗(yàn)。有些腐生葡萄球菌和松鼠葡萄球菌及某些微球菌屬的菌種可能膠乳凝集試驗(yàn)陽(yáng)性，但玻片凝固酶試驗(yàn)通常陰性。

（3）試管法：須制備濃厚的均勻菌懸液，以便觀察結(jié)果。
a.試管法葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者，應(yīng)見(jiàn)到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應(yīng)判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌需要較長(zhǎng)時(shí)間（4H以上）孵育，才可出現(xiàn)陽(yáng)性。
b.如果培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)4H，應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)：
Ⅰ.延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后，有些菌株產(chǎn)生的葡萄球菌激酶（溶纖維蛋白酶），可以裂解凝塊，產(chǎn)生假陰性結(jié)果；
Ⅱ.如果使用的血漿不是無(wú)菌的（或部分不是無(wú)菌的），假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果均有可能發(fā)生；
Ⅲ.所用待測(cè)菌不純，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后，污染菌可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。在這點(diǎn)上，含EDTA的血漿優(yōu)于檸檬酸鹽血漿，因?yàn)槔脵幟仕猁}的細(xì)菌（如一些鏈球菌）可能通過(guò)消耗檸檬酸鹽促進(jìn)凝集發(fā)生。
Ⅳ.所用血漿缺乏纖維蛋白原（脫纖維血漿）。

（4）最好用EDTA抗凝的兔血漿，不主張用人的抗凝血，除非經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證實(shí)其中不含感染因子、沒(méi)有凝血能力和沒(méi)有抑制因子。不同種動(dòng)物血漿因子不同，凝固狀態(tài)也不同，兔血漿凝塊結(jié)實(shí)，凝固速度快，優(yōu)于人血漿。

（5）試驗(yàn)不可在高鹽培養(yǎng)基上的取菌落，因?yàn)榭赡艹霈F(xiàn)自凝或假陽(yáng)性。

（6）若被檢菌為陳舊的肉湯培養(yǎng)物（超過(guò)18～24H），或生長(zhǎng)不良，凝固酶活性低的菌株可能檢測(cè)不出來(lái)。

(7)為防止玻片法檢測(cè)的假陽(yáng)性反應(yīng)，必須嚴(yán)格按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行操作。當(dāng)懷疑待測(cè)菌是金黃色葡萄球菌時(shí)，對(duì)玻片凝固酶陰性的結(jié)果應(yīng)做試管法凝固酶試驗(yàn)確證。玻片法和試管法凝固酶試驗(yàn)的血漿標(biāo)準(zhǔn)是:必須含有足夠濃度的凝固酶反應(yīng)因子和纖維蛋白原，必須無(wú)溶纖維蛋白活性和無(wú)抑制劑。

附：
1.玻片法檢測(cè)血漿凝固酶陽(yáng)性的菌有：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、里昂葡萄球菌（即：路鄧葡萄球菌Staphylococcus lugdunensis）、施氏葡萄球菌凝聚亞種（Staphylococcusschleiferi ssp. coagulans）及部份中間型葡萄球菌（staphylococcusintermedius）。

2.試管法檢測(cè)血漿凝固酶陽(yáng)性的菌有：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、施氏葡萄球菌凝聚亞種（Staphylococcusschleiferi ssp. coagulans）、中間型葡萄球菌（staphylococcusintermedius）、海豚葡萄球菌(Staphylococusdelphini)及部份豬葡萄球菌（staphylococcushyicus)。

3.我做的試管法試驗(yàn)圖：
左：測(cè)定管(陰性)，右：標(biāo)準(zhǔn)金葡菌株(陽(yáng)性)

4.關(guān)于路鄧葡萄球菌Staphylococcus ?lugdunensis）：菌落直徑常為4～7MM，平滑，有光澤，可能無(wú)色素沉著或呈現(xiàn)奶油色至橘黃色。邊緣完整，相當(dāng)扁平，中心呈輕微圓錐狀凸起。玻片凝固酶試驗(yàn)（+）?？煞纸夂Ｔ逄?、甘露糖、麥芽糖、蔗糖且產(chǎn)酸，不分解甘露醇且不產(chǎn)酸。PYR（pyrrolidonase：吡咯烷酮基芳胺酶）(+)、ODC（+）（培養(yǎng)8H觀察，此時(shí)表皮葡萄球菌為陰性。）。

5.關(guān)于施氏葡萄球菌（Staphylococcus schleiferi ssp.）：菌落直徑常為3～5MM且無(wú)色素沉著，光滑有光澤，輕微凸起，邊緣完整。玻片凝固酶試驗(yàn)（+）。PYR（pyrrolidonase：吡咯烷酮基芳胺酶）(+)?？煞纸飧事短?，有時(shí)也分解海藻糖而產(chǎn)酸，但不分解甘露醇、麥芽糖或蔗糖。